Диагностика перестроек генов

Перестройки генов NTRK и ROS1 в клетках опухоли можно обнаружить с достаточной точностью только при проведении чувствительных и специфичных исследований1–3

Существует множество молекулярных исследований, предназначенных для обнаружения перестроек генов, однако некоторые из этих исследований имеют более высокую специфичность, чем другие1,2,4–11.
Высокопроизводительное секвенирование (ВПС, англ. NGS) отличается высокой чувствительностью, точностью и производительностью, что необходимо для исследования всех слияний генов9–16.

Доступные технологии обнаружения слияния генов

Высокопроизводительное секвенирование

Возможность обнаружения различных перестроек	*Обнаружение перестроек всех трех генов NTRK* и гена ROS1^4,9** NGS представляет собой чувствительный и специфичный метод, позволяющий обнаружить все возможные варианты слияний генов NTRK, а также выявить другие биомаркеры в рамках одного комплексного молекулярного исследования. При использовании метода NGS на основе РНК можно определить партнеров слияния гена ROS1, а также местоположение перестроек гена^4,5,9.
Надежность	Надежность исследования зависит от его типа¹⁷ Разные панели NGS оценивают разные участки последовательности ДНК или РНК, а глубина покрытия зависит от типа исследования. Требования к содержанию опухолевых клеток также могут не совпадать в случае различных исследований¹⁷.
Преимущества	Возможность обнаружения новых генов-партнеров и оценки нескольких значимых биомаркеров¹⁸ В зависимости от варианта используемого метода, NGS может выявлять множество известных генов-партнеров, так и новые варианты перестроек, используя небольшой объем опухолевой ткани. При секвенировании РНК рассматриваются кодирующие последовательности, а не интроны, данный метод подходит для обнаружения слияния генов^5,18.
Недостатки	*Может пропустить некоторые перестройки генов NTRK/ROS1¹⁸* Ограничением метода NGS на основе ДНК является размер интронов. Метод NGS на основе РНК подходит для обнаружения слияния генов, однако его применение может быть ограничено качеством РНК^5,18.
Пример	*При заказе исследования методом NGS запросите провести проверку слияний всех трех генов NTRK: NTRK1, NTRK2* и NTRK3¹⁹.** Результаты исследования помогут установить наличие слияний генов NTRK в образцах солидных опухолей. Содержание отчета, составляемого для определенного пациента, зависит от метода исследования и лаборатории.

Иммуногистохимическое исследование (ИГХ)

Возможность обнаружения различных перестроек	Возможность обнаружения белков, кодируемых генами NTRK и ROS1, сопряженная с необходимостью подтверждения перестройки с помощью молекулярно-генетических методов^2,5,9,13 Данное исследование может проводиться только в качестве скринингового. Требуется подтверждение наличия слияний генов другим методом. Антитела к pan-TRK позволяют оценить экспрессию белка, кодируемого любым из трех генов NTRK, но не позволяют различить белки дикого типа и химерные белки^2,5,13.
Надежность	Обнаружение белков TRK и ROS1 с высокой специфичностью и чувствительностью^2,5 По имеющимся данным, чувствительность антител к pan-TRK составляет 95–100%, а их специфичность доходит до 100% в случае белков TRK. Сообщалось, что антитела к ROS1 обладают 100-процентной чувствительностью, а их специфичность находится в диапазоне от 70 до 100 % — в зависимости от порога, используемого для определения положительного результата^2,9,10.
Преимущества	Низкая стоимость и доступность^2,9,18 При использовании антител к pan-TRK можно обнаружить белки TRK A, B и C (время получения результатов составляет 1–2 дня)¹⁸.
Недостатки	Невозможность достоверной дифференциации экспрессии нормальных белков и белков, образовавшихся в результате перестроек генов^9,18 ИГХ позволяет обнаруживать как белки дикого типа, так и химерные белки TRK и ROS1, из-за чего результаты могут оказаться ложноположительными. Кроме того, существует риск получения ложноотрицательных результатов в случае слияний с участием TRKC. Таким образом, для подтверждения наличия перестроек генов требуется задействовать молекулярно-генетические методы^9,18.
Пример	Исследование с применением антител к pan-TRK: окрашивание при перестройке EML4-NTRK1 при колоректальном раке (слева) и ETV6-NTRK3 при секреторной карциноме (справа) Наличие перестройки генов определено по результатам секвенирования нового поколения²⁰.

Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH)

Возможность обнаружения различных перестроек	*Возможность обнаружения перестроек генов NTRK* и ROS1 зависит от используемых зондов^18,19** Для диагностики перестроек каждого гена NTRK требуются отдельные зонды²¹. Для обнаружения перестройки гена ROS1 используются двухцветные ‘break-apart’ зонды, которые помечают 3’-концевой (центромерный) участок гена флуорохромом одного цвета, а 5’-концевой (теломерный) участок — флуорохромом другого цвета. Перестройки выявляются по паттерну экспрессии флуорохромов^9,21.
Надежность	Возможны ложноположительные или ложноотрицательные результаты^9,18 Существует риск получения ложноположительных результатов из-за комплексных хромосомных транслокаций, а также вероятность обнаружения перестроек, не приводящих к образованию функциональных химерных белков^9,18. Возможен пропуск вариативных или комплексных перестроек^1,2,9,18. В некоторых случаях доля ложноотрицательных результатов может превышать 30%¹⁸.
Преимущества	*Метод FISH с применением ‘break-apart’ зондов — это золотой стандарт обнаружения перестроек гена ROS1^10,21* Данный метод позволяет визуализировать целевой объект в клетке, а также исследовать несколько мишеней в одном образце при помощи нескольких флуорофоров^10,18. Использование ‘break-apart’ зондов обеспечивает обнаружение слияний с неизвестными партнерами¹⁸.
Недостатки	Потенциальная необходимость проведения нескольких исследований методом традиционной FISH для обнаружения слияний генов NTRK В случае традиционной FISH должна быть известна таргетная последовательность, а для генов NTRK1, NTRK2 и NTRK3 необходимо проводить три отдельных исследования¹⁸. Кроме того, в зависимости от типа транслокации существует риск получения ложноположительных или ложноотрицательных результатов^9,18.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Возможность обнаружения различных перестроек	Необходимость использования нескольких наборов праймеров для обнаружения слияний генов^18,22 Поскольку расположение перестроек гена на момент проведения исследования неизвестно, необходимо использовать несколько наборов праймеров — по одному на каждый вариант слияния^18,21,22.
Надежность	Надежный в случае известных слияний генов, необходимость подтверждения результата исследования наличия слияний гена ROS1 с помощью метода FISH¹⁰ Для каждого варианта слияния требуется использовать особый набор праймеров. Таким образом, в случае метода ПЦР неизвестные или непроверявшиеся варианты могут быть пропущены^7,9,21,22. Экспрессия гена ROS1 выявляется в нормальной ткани легких, поэтому результата ПЦР-исследования, не подтвержденного результатом исследования методом FISH, недостаточно для того, чтобы диагностировать ROS1-положительный рак легкого^11,22.
Преимущества	Низкая стоимость одного исследования, отличающегося высокой чувствительностью и специфичностью¹⁸
Недостатки	Возможность обнаружения только известных перестроек генов¹⁸ Таргетные последовательности должны быть известны. Выявлять новых партнеров слияния при применении только этого метода невозможно. Проведение комплексного мультиплексного исследования методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) может быть сопряжено с трудностями из-за потенциального наличия множества 5’-концевых партнеров слияния^10,18.

Скачайте наше руководство по исследованию наличия слияния генов NTRK

Проведение надлежащих молекулярных исследований потенциально способствует обнаружению слияний генов4,5,18
Патоморфолог может посоветовать, какой метод исследования будет оптимальным в каждом конкретном случае

Диагностика NTRK:

Программа поддержки диагностики транслокаций генов NTRK для взрослых пациентов с солидными опухолями*
Телефон горячей линии: 8 (800) 100-68-53

Полезные материалы:

Схемы и алгоритмы диагностики мутаций генов при солидных опухолях
Часто задаваемые вопросы по программе поддержки логистики для ngs‑диагностики биоматериала пациентов

Сноски:
FISH — флуоресцентная гибридизация ДНК in situ; ИГХ — иммуногистохимическое исследование; NGS — секвенирование нового поколения; ПЦР — полимеразная цепная реакция; ОТ-ПЦР — полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией

*Технический оператор АО «Астон Консалтинг», при поддержке АО «Рош Москва». Есть исключения, подробные детали уточнять на горячей линии проекта. Данная информация предназначена только для медицинских работников и не должна передаваться пациентам. Данная программа не имеет целью способствовать продвижению какой-либо продукции/услуг компании «Рош», носит информационный характер и направлена на повышение доступности молекулярно-генетических исследований для пациентов. Участие в программе само по себе не является основанием для принятия каких-либо решений о применении какого-либо препарата.

Su D, et al. J Exp Clin Cancer Res 2017;36:1–12.

Hechtman JF, et al. Am J Surg Pathol 2016;41:1547–1551.

Kumar-Sinha C, et al. Genome Med 2015;7:1–18.

Vaishnavi A, et al. Cancer Discov 2015;5:25–34.

Murphy DA, et al. Appl Immunohistochem Mol Morphol 2017;25:513–523.

Stack EC, et al. Methods 2014;70:46–58.

Knezevich SR, et al. Nat Genet 1998;18:184–187.

Naidoo J, Drilon A. Am J Hematol Oncol 2014;10:4–11.

International Association for the Study of Lung Cancer. IASLC Atlas of ALK and ROS1 Testing in Lung Cancer. URL: https://www.iaslc.org/research-education/publications-resources-guidelines/iaslc-atlas-alk-and-ros1-testing-lung-cancer (по состоянию на ноябрь 2020 г.).

Shan L, et al. PLoS One 2015;10:e0120422.

Bubendorf L, et al. Virchows Arch 2016;469:489–503.

Cao B, et al. Onco Targets Ther 2016;31:131–138.

Национальная всеобщая онкологическая сеть (NCCC). Клинические рекомендации NCCN для онкологов (NCCN Guidelines) по немелкоклеточному раку легкого. Версия 6.2020, 2020 г. URL: https://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/nscl.pdf (по состоянию на ноябрь 2020 г.).

Zheng Z, et al. Nat Med 2014;20:1479–1484.

Drilon A, et al. Clin Cancer Res 2015;21:3631–3639.

Grada A, Weinbrecht K. J Invest Dermatol 2013;133:e11.

Horak P, et al. ESMO Open 2016;1:e000094.

Penault-Llorca F, et al. J Clin Pathol 2019;72:460–467.

Kummar S, Lassen UN. Target Oncol 2018;13:545–556.

Листок-вкладыш анализа VENTANA с применением антител к pan-TRK (EPR17341), 1017533EN, ред. A.

Rossi G, et al. Lung Cancer (Auckl) 2017;8:45–55.

Ali G, et al. Arch Pathol Lab Med 2018;142:480–489.

Для пациентов с солидными опухолями

Прочитайте больше

Перестройки генов NTRK и ROS1 в клетках опухоли можно обнаружить с достаточной точностью только при проведении чувствительных и специфичных исследований^1–3

Доступные технологии обнаружения слияния генов

Высокопроизводительное секвенирование

Иммуногистохимическое исследование (ИГХ)

Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH)

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Проведение надлежащих молекулярных исследований потенциально способствует обнаружению слияний генов^4,5,18

Патоморфолог может посоветовать, какой метод исследования будет оптимальным в каждом конкретном случае

Диагностика NTRK:

Полезные материалы:

У меня остались вопросы