Возможность обнаружения различных перестроек

Обнаружение перестроек всех трех генов NTRK и гена ROS1^4,9

NGS представляет собой чувствительный и специфичный метод, позволяющий обнаружить все возможные варианты слияний генов NTRK, а также выявить другие биомаркеры в рамках одного комплексного молекулярного исследования. При использовании метода NGS на основе РНК можно определить партнеров слияния гена ROS1, а также местоположение перестроек гена^4,5,9.

Надежность

Надежность исследования зависит от его типа¹⁷

Разные панели NGS оценивают разные участки последовательности ДНК или РНК, а глубина покрытия зависит от типа исследования. Требования к содержанию опухолевых клеток также могут не совпадать в случае различных исследований¹⁷.

Преимущества

Возможность обнаружения новых генов-партнеров и оценки нескольких значимых биомаркеров¹⁸

В зависимости от варианта используемого метода, NGS может выявлять множество известных генов-партнеров, так и новые варианты перестроек, используя небольшой объем опухолевой ткани. При секвенировании РНК рассматриваются кодирующие последовательности, а не интроны, данный метод подходит для обнаружения слияния генов^5,18.

Недостатки

Может пропустить некоторые перестройки генов NTRK/ROS1¹⁸

Ограничением метода NGS на основе ДНК является размер интронов. Метод NGS на основе РНК подходит для обнаружения слияния генов, однако его применение может быть ограничено качеством РНК^5,18.

Пример

При заказе исследования методом NGS запросите провести проверку слияний всех трех генов NTRK: NTRK1, NTRK2 и NTRK3¹⁹.

Результаты исследования помогут установить наличие слияний генов NTRK в образцах солидных опухолей. Содержание отчета, составляемого для определенного пациента, зависит от метода исследования и лаборатории.

Возможность обнаружения различных перестроек

Возможность обнаружения белков, кодируемых генами NTRK и ROS1, сопряженная с необходимостью подтверждения перестройки с помощью молекулярно-генетических методов^2,5,9,13

Данное исследование может проводиться только в качестве скринингового. Требуется подтверждение наличия слияний генов другим методом. Антитела к pan-TRK позволяют оценить экспрессию белка, кодируемого любым из трех генов NTRK, но не позволяют различить белки дикого типа и химерные белки^2,5,13.

Надежность

Обнаружение белков TRK и ROS1 с высокой специфичностью и чувствительностью^2,5

По имеющимся данным, чувствительность антител к pan-TRK составляет 95–100%, а их специфичность доходит до 100% в случае белков TRK. Сообщалось, что антитела к ROS1 обладают 100-процентной чувствительностью, а их специфичность находится в диапазоне от 70 до 100 % — в зависимости от порога, используемого для определения положительного результата^2,9,10. 

Преимущества

Низкая стоимость и доступность^2,9,18

При использовании антител к pan-TRK можно обнаружить белки TRK A, B и C (время получения результатов составляет 1–2 дня)¹⁸.

Недостатки

Невозможность достоверной дифференциации экспрессии нормальных белков и белков, образовавшихся в результате перестроек генов^9,18

ИГХ позволяет обнаруживать как белки дикого типа, так и химерные белки TRK и ROS1, из-за чего результаты могут оказаться ложноположительными. Кроме того, существует риск получения ложноотрицательных результатов в случае слияний с участием TRKC. Таким образом, для подтверждения наличия перестроек генов требуется задействовать молекулярно-генетические методы^9,18.

Пример

Исследование с применением антител к pan-TRK: окрашивание при перестройке EML4-NTRK1 при колоректальном раке (слева) и ETV6-NTRK3 при секреторной карциноме (справа)

Наличие перестройки генов определено по результатам секвенирования нового поколения²⁰.

Возможность обнаружения различных перестроек

Возможность обнаружения перестроек генов NTRK и ROS1 зависит от используемых зондов^18,19

Для диагностики перестроек каждого гена NTRK требуются отдельные зонды²¹. Для обнаружения перестройки гена ROS1 используются двухцветные ‘break-apart’ зонды, которые помечают 3’-концевой (центромерный) участок гена флуорохромом одного цвета, а 5’-концевой (теломерный) участок — флуорохромом другого цвета. Перестройки выявляются по паттерну экспрессии флуорохромов^9,21.

Надежность

Возможны ложноположительные или ложноотрицательные результаты^9,18

Существует риск получения ложноположительных результатов из-за комплексных хромосомных транслокаций, а также вероятность обнаружения перестроек, не приводящих к образованию функциональных химерных белков^9,18. Возможен пропуск вариативных или комплексных перестроек^1,2,9,18. В некоторых случаях доля ложноотрицательных результатов может превышать 30%¹⁸.

Преимущества

Метод  FISH с применением ‘break-apart’ зондов — это золотой стандарт обнаружения перестроек гена ROS1^10,21

Данный метод позволяет визуализировать целевой объект в клетке, а также исследовать несколько мишеней в одном образце при помощи нескольких флуорофоров^10,18. Использование ‘break-apart’ зондов обеспечивает обнаружение слияний с неизвестными партнерами¹⁸.

Недостатки

Потенциальная необходимость проведения нескольких исследований методом традиционной FISH для обнаружения слияний генов NTRK

В случае традиционной FISH должна быть известна таргетная последовательность, а для генов NTRK1, NTRK2 и NTRK3 необходимо проводить три отдельных исследования¹⁸. Кроме того, в зависимости от типа транслокации существует риск получения ложноположительных или ложноотрицательных результатов^9,18.

Возможность обнаружения различных перестроек

Необходимость использования нескольких наборов праймеров для обнаружения слияний генов^18,22

Поскольку расположение перестроек гена на момент проведения исследования неизвестно, необходимо использовать несколько наборов праймеров — по одному на каждый вариант слияния^18,21,22.

Надежность

Надежный в случае известных слияний генов, необходимость подтверждения результата исследования наличия слияний гена ROS1 с помощью метода FISH¹⁰

Для каждого варианта слияния требуется использовать особый набор праймеров. Таким образом, в случае метода ПЦР неизвестные или непроверявшиеся варианты могут быть пропущены^7,9,21,22. Экспрессия гена ROS1 выявляется в нормальной ткани легких, поэтому результата ПЦР-исследования, не подтвержденного результатом исследования методом FISH, недостаточно для того, чтобы диагностировать ROS1-положительный рак легкого^11,22.

Преимущества

Недостатки

Возможность обнаружения только известных перестроек генов¹⁸

Таргетные последовательности должны быть известны. Выявлять новых партнеров слияния при применении только этого метода невозможно. Проведение комплексного мультиплексного исследования методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) может быть сопряжено с трудностями из-за потенциального наличия множества 5’-концевых партнеров слияния^10,18.