Использование технологии флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) для диагностики перестроек генов семейства NTRK с целью назначения терапии препаратом энтректиниб

Григорий Анатольевич Цаур,
ГАУЗ СО «Областная детская клиническая больница», Екатеринбург, ул. Серафимы Дерябиной, 32
ГАУЗ СO «Институт медицинских клеточных технологий», Екатеринбург, ул. Карла Маркса, 22а
ФГБОУ ВПО «Уральский государственный медицинский университет Минздрава России», Екатеринбург, ул. Репина, 3

Метод флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) широко используется для обнаружения химерных генов у пациентов с онкологическими заболеваниями для установления диагноза и для поиска мишеней с целью назначения таргетной терапии. С диагностическими целями наиболее широко применяются зонды для выявления перестроек гена SS18 (ранее известного как SYT) у пациентов с синовиальной саркомой, гена EWSR1 при саркоме Юинга, миксоидной липасаркоме, десмоплатической мелкокруглоклеточной опухоли, экстраскелетной миксоиодной хондрокарциноме и ряде других. В качестве примеров предиктивных маркеров, выявляемых методом FISH, можно привести перестройки генов ALK, ROS1 и RET при немелкоклеточном раке легкого.¹ Еще одной мишенью, для выявления которой широко применятся данная диагностическая технология, являются перестройки генов семейства NTRK, включающего гены NTRK1, NTRK2 и NTRK3².

Положительный результат FISH означает, что в исследуемом образце выявлена хромосомная перестройка (структурный вариант), включающая тестируемый ген, и в частности, один из генов семейства NTRK². 

Существует 2 варианта зондов для выявления перестроек генов семейства NTRK: 

1. Зонды на точку разрыва (break-apart probes). При использовании данных зондов две части исследуемого гена и рядом расположенные последовательности окрашиваются разными (чаще зеленым и оранжевым, иногда красным) флуоресцентными красителями.

 При отсутствии перестройки какого-либо из генов семейства NTRK зеленые и оранжевые флуоресцентные сигналы располагаются рядом, часто перекрывая друг друга, что дает 2 желтых сигнала (соответствующих материнской и отцовской копиям гена), а при наличии перестройки – будут выявляться 1 зеленый и 1 оранжевый флуоресцентные сигналы по отдельности и 1 желтый сигнал (соответствует второй неизмененной копии гена в клетке (рис. 1, 3А).

Также частным случаем перестройки любого из генов семейства NTRK является т.н. 5’ делеция, при которой начальная часть гена (она и обозначается 5’) утрачивается, но к сохраненному тирозинкиназному домену NTRK присоединяется ген-партнер, что и ведет к его постоянной активации. В этих случаях при флуоресцентной микроскопии выявляется 1 оранжевый флуоресцентный сигнал и 1 желтый сигнал (рис. 2). И при 5’ делециях и при обычных перестройках генов семейства NTRK порогом позитивности является величина в 20% от числа проанализированных клеток.

Зонды такого типа потенциально могут выявлять любую перестройку в генах NTRK1, NTRK2 и NTRK3 независимо от гена-партнера.

2. Двухцветные зонды с двойным слиянием (Dual color dual fusion probes) такой вариант зондов для выявления химерных генов предусматривает, что последовательность, комплементарная гену семейства NTRK и рядом расположенным регионам окрашивается каким-то одним флуоресцентным красителем (например, зеленым), а последовательность гена-партнера - другим флуоресцентным красителем (например, оранжевым). 

При отсутствии перестройки искомых генов выявляются 2 зеленых и 2 оранжевых флуоресцентных сигнала, расположенные раздельно, а при наличии слияния генов детектируются по 1 зеленому и 1 оранжевому флуоресцентным сигналам (это неизмененные гены, например, NTRK3 и ETV6) и двум желтым сигналам (это прямой и реципрокный химерные гены (Рис. 4).

Такой тип зондов применятся только для детекции самой частой из перестроек NTRK – ETV6::NTRK3. 

Рисунок 1.
Выявление перестройки гена NTRK1 у пациентки с диффузной формой дисэмбриопластической нейроэпителиальной опухоли, grade 1. Использован зонд ZytoLight SPEC NTRK1 Dual Color Break Apart Probe (Zytovison, Германия). Здесь и далее на рисунках в качестве примеров положительных результатов клетки с разделёнными флуоресцентными сигналами обведены белым контуром. Также в представленном поле зрения есть и другие позитивные клетки с наличием перестройки NTRK1 

Рисунок 2.
Выявление 5’ делеции  гена NTRK2 у пациентки с эмбриональной опухолью ЦНС, БДУ, Grade 4. Большинство клеток в поле зрения – триплоидные. Использован зонд ZytoLight SPEC NTRK2 Dual Color Break Apart Probe (Zytovison, Германия). Позднее с использованием панели FusionPlex Lung v2 panel (Invitae, США) и технологии высокопроизводительного секвенирования верифицировано наличие химерного транскрипта GKAP1::NTRK2 (ex10-ex13).

Рисунок 3.
Выявление перестройки генов NTRK3 (A) и ETV6 (Б), что соответствует наличию химерного гена ETV6::NTRK3,  у пациента с мезобластной нефромой. Использованы зонды ZytoLight SPEC NTRK3 Dual Color Break Apart Probe (Zytovison, Германия) и XL ETV6 Break Apart Probe (Metasystems, Германия). 

Рисунок 4.
Выявление химерного гена ETV6::NTRK3 у пациентки с инфантильной фибросаркомой.  Большинство клеток в поле зрения – полиплоидные. Использован зонд Fast Probe ETV6/NTRK3 t(12;15) Gene fusion Probe Detection Kit (Wuhan HealthCare Biotechnology, Китай).

Рекомендации по диагностике перестроек генов семейства NTRK

Согласно рекомендациям ESMO по диагностике перестроек генов семейства NTRK, метод FISH может использоваться как подтверждающий тест при гистологических типах опухолей с высокой частотой перестроек NTRK, таких как секреторная карцинома слюнной и молочной желез, инфантильная фибросаркома, мезобластная нефрома².  

Метод FISH демонстрирует высокую чувствительность в отношении хромосомных перестроек с каноническими точками разрыва. Однако существует вероятность ложноотрицательных результатов FISH при коротких парацентрических инверсиях и внутрихромосомных перестройках, которые встречаются среди перестроек гена NTRK1 (но описаны и для других генов), и могут быть интерпретированы как ложноотрицательные из-за недостаточного для расхождения FISH-сигналов³.

Ограничением для широкого использования FISH для диагностики перестроек генов семейства NTRK при остальных солидных опухолях также является тот факт, что FISH не обладает способностью определять функциональное значение выявленной перестройки, то есть не представляется возможным установить, приводит ли данная перестройка к экспрессии химерного белка или является неактивным следствием хромосомной нестабильности опухолевого генома. В последнем случае в опухоли отсутствует экспрессия онкогенного химерного белка TRK - мишени для действия TRK-ингибитора⁴. Этим же недостатком может обладать и высокопроизводительное секвенирование (ВПС), когда в качестве исходного материала используется ДНК из ткани опухоли, а лишены этого недостатка лишь ВПС РНК-секвенирование, ОТ-ПЦР и, отчасти, ИГХ².

Еще одним из известных недостатков является то, что интерпретация результатов FISH является субъективной, что может привносить дополнительные ошибки при описании результатов гибридизации³. В качестве примера можно привести данные O. Gautschi et al, которыми описано два случая ложноположительных реакций FISH c зондами для генов семейства NTRK. Первый случай описывает карциному околоушной железы с пограничным результатом FISH для NTRK1 (18% положительных клеток). В образце не было выявлено экспрессии pan-TRK по результатам ИГХ, а также не выявлено перестройки по результатам двух различных методов анализа  (Oncomine Focus и Archer FusionPlex). Второй случай описывает аденокарциному желудочно-кишечного тракта, в которой методом FISH в 50% клеток была выявлена перестройка NTRK3, но при этом, по данным ВПС перестройки NTRK по не обнаружены. ИГХ во втором случае не было проведено из-за недостатка опухолевого материала⁵. 

Показания для назначения TRK-ингибитора энтректиниб 

Согласно общей характеристике лекарственного препарата (ОХЛП) энтректиниб, одобренной на территории ЕС, энтректиниб в виде монотерапии показан к применению у взрослых и детей в возрасте от 12 лет и старше с солидными опухолями, экспрессирующими химерный ген с участием нейротрофной рецепторной тирозинкиназы (NTRK):

• у которых заболевание является местно-распространенным, метастатическим или в том случае, если хирургическая резекция, вероятно, приведет к тяжелым осложнениям, и
• которые ранее не получали ингибитор NTRK;
• у которых отсутствуют удовлетворительные варианты терапии⁶.

Таким образом, в ОХЛП указано, что показанием для назначения препарата является наличие экспрессии химерного гена NTRK⁶. К исследованиям, которые позволяют определить функциональную активность перестройки относятся ИГХ с антителом к pan-TRK, полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) и ВПС².

Заключение

При выявлении структурной перестройки с участим гена семейства NTRK методом FISH может быть рассмотрена возможность проведения дополнительного исследования для назначения лекарственной терапии. Поскольку опухоли с перестройками генов семейства NTRK встречаются редко, а их тестирование остается сложной задачей, положительные результаты тестов следует обсудить с экспертными центрами, имеющими доступ к различным методам диагностики, учитывая также общее состояние пациента, гистологический тип опухоли, количество и качество доступного биоматериала для исследования, возможность и риски проведения повторной биопсии, сроки проведения исследования, ожидаемую пользу и риски от назначения TRK-ингибитора, а также доступные варианты стандартной терапии.