Микросателлитная нестабильность в онкологии

Микросателлитная нестабильность (МСН; microsatellite instability, MSI) — молекулярный феномен, при котором в опухолевой ДНК накапливаются делеции и инсерции в коротких тандемных повторах — микросателлитах. Основная причина MSI — нарушение работы системы репарации неспаренных оснований ДНК (mismatch repair deficiency, dMMR). Поэтому в клинической практике используются два связанных, но не полностью тождественных понятия: MSI как молекулярный результат нестабильности микросателлитов и dMMR как функциональный дефицит системы репарации, определяемый по утрате экспрессии белков MLH1, MSH2, MSH6 и PMS2 при иммуногистохимическом исследовании¹.

Тестирование MSI/dMMR является обязательным компонентом молекулярно-патологического исследования при колоректальном раке и ряде других злокачественных новообразований, поскольку служит инструментом скрининга синдрома Линча и предиктором ответа на иммунотерапию ингибиторами контрольных точек.

Исторический контекст и клиническое значение

Феномен микросателлитной нестабильности был впервые описан в 1993 году тремя независимыми группами исследователей в ходе изучения ДНК колоректальных аденокарцином^1,2. С тех пор понимание его молекулярных механизмов существенно расширилось, а клиническое значение тестирования MSI стало определяющим в двух ключевых практических направлениях³.

Во-первых, в 2017 году FDA (Food and Drug Administration, США) одобрило применение пембролизумаба у пациентов с нерезектабельными или метастатическими MSH/dMMR солидными опухолями при прогрессировании после предшествующей терапии и отсутствии удовлетворительных альтернатив. Это было первое одобрение FDA, не связанное с локализацией опухоли, когда биомаркер, а не орган-источник определяет показание к терапии⁴.

Это решение обусловлено высокой иммуногенностью MSI-опухолей: число неоантигенов в них в 10–50 раз превышает таковое при микросателлитно-стабильных новообразованиях³.

Во-вторых, выявление MSI/dMMR — ключевой шаг в скрининге синдрома Линча, аутосомно-доминантного наследственного синдрома, обусловленного герминальными патогенными вариантами в генах MLH1, MSH2, MSH6 или PMS2. МСН выявляется более чем в 95% опухолей, ассоциированных с этим синдромом². При этом около 3% всех случаев колоректального рака (КРР) обусловлено синдромом Линча, тогда как в спорадических опухолях MSI определяется в 12% случаев².

Помимо предиктивной значимости, статус MSI имеет прогностическое значение: наличие МСН является положительным прогностическим фактором, особенно при II стадии КРР. При метастатическом (IV стадия) КРР MSI встречается лишь у 2–4% пациентов².

Молекулярная биология МСН: от структуры микросателлитов к механизму нестабильности

Микросателлиты, или короткие тандемные повторы (short tandem repeats, STR), представляют собой гомополимерные участки ДНК с единицей повтора от 1 до 6 нуклеотидов³. Они равномерно распределены по геному человека в кодирующих и некодирующих регионах. Числовое обозначение ряда маркеров указывает на количество повторяющихся элементов: BAT-25 содержит 25 повторов нуклеотида T, BAT-26 — 26 повторов A¹. Наряду с высоковариабельными, существуют так называемые квазимономорфные последовательности с крайне малым аллельным разнообразием, используемые как маркеры для оценки MSI³.

При репликации ДНК фермент ДНК-полимераза может «проскальзывать» по повторяющимся участкам, образуя новую молекулу ДНК измененной длины^{1, 3}. Особую опасность представляют мутации STR в кодирующих регионах: они вызывают сдвиг рамки считывания, инициируя злокачественную трансформацию. В некодирующих участках возможно возникновение альтернативных сайтов сплайсинга³.

В норме «проскальзывание» полимеразы корректируется системой репарации ошибочно спаренных оснований MMR, основные компоненты которой, белки MLH1, MSH2, MSH6 и PMS2, функционируют в виде гетеродимерных комплексов^{1, 3}.

Гетеродимер MutSα (MSH2–MSH6) распознает некомплементарные нуклеотиды и инсерции или делеции размером до двух пар нуклеотидов; гетеродимер MutSβ (MSH2–MSH3) выявляет более протяженные нарушения. После фиксации дефекта рекрутируется MutLα (MLH1–PMS2), взаимодействие с которым активирует экзонуклеазу I (EXO I), вырезающую дефектный участок. Затем высокоточная полимераза δ достраивает верную последовательность³.

При синдроме Линча причиной dMMR служат герминальные патогенные варианты генов MLH1, MSH2, MSH6 или PMS2^1–3. Также причиной синдрома Линча являются протяженные делеции гена EPCAM, который не является участником системы MMR, но локализуется непосредственно перед геном MSH2. Таким образом, крупная делеция гена EPCAM приводит к гиперметилированию гена MSH2⁵. В спорадических опухолях причина МСН — преимущественно биаллельное гиперметилирование промоторного участка гена MLH1, характерное для CIMP-фенотипа КРР³. Потеря экспрессии пары MLH1/PMS2 в большинстве случаев обусловлена спорадическим гиперметилированием промотора MLH1. Напротив, изолированная потеря MSH2/MSH6, MSH6 или PMS2 с вероятностью более 90% свидетельствует о наследственном патогенном варианте в соответствующем гене^1,3.

Клинические показания к тестированию MSI/dMMR

Исследование MSI/dMMR при КРР рекомендовано в нескольких направлениях.

Как инструмент скрининга синдрома Линча^{5, 6}. Поскольку синдром Линча составляет лишь около 3% всех случаев КРР, универсальное тестирование позволяет избежать дорогостоящей ДНК-диагностики у пациентов, в опухолях которых MSI отсутствует. При выявлении MSI/dMMR пациенту показана генетическая консультация.

Выявление в MSI-опухоли соматической мутации в гене BRAF p.V600E и/или гиперметилирования промотора MLH1, традиционно считавшееся признаком спорадического происхождения, не исключает синдром Линча полностью, поскольку оба события, хотя и редко, могут встречаться в опухолях пациентов с наследственным синдромом¹.

Отбор пациентов на иммунотерапию. Наличие MSI/dMMR является предиктором ответа на ингибиторы контрольных точек иммунного ответа (PD-1/PD-L1, CTLA-4) при злокачественных новообразованиях любой локализации^4,6. При метастатическом MSH/dMMR КРР объективный ответ на монотерапию ингибиторами PD-1/PD-L1 достигает 31–44%, а при комбинации блокаторов PD-1 и CTLA-4 — 65–70%^{6, 7}. При применении в неоадъювантном режиме полный патоморфологический ответ достигается у подавляющего большинства пациентов с местно-распространенными MSH/dMMR опухолями (до 75%)⁷.

Прогностическое и предиктивное значение при ранних стадиях. При II стадии КРР наличие MSI является положительным прогностическим фактором. Кроме того, установлено, что MSI-опухоли при II стадии нечувствительны к адъювантной химиотерапии 5-фторурацилом (5-ФУ), что является основанием для отказа от ее назначения у данных пациентов^2,3. Статус MSI/dMMR может определяться несколькими методами.

Иммуногистохимическое исследование (ИГХ)

ИГХ-исследование экспрессии белков MMR получило широкое распространение благодаря доступности, совместимости со стандартным оборудованием патологоанатомических лабораторий и возможности получить информацию о конкретном белке, экспрессия которого утрачена^1,3,6.

В РФ для ИГХ-диагностики статуса MSI/dMMR зарегистрированы реагенты четырех производителей:

• «Roche Diagnostics» (Германия);
• ООО «ПраймБиоМед» (Россия);
• «Dartmon» (КНР);
• «Селл Марк Корпорейшн» (США).

Панель VENTANA MMR IHC (Roche Diagnostics) включает антитела к MLH1 (клон M1), MSH2 (G219-1129), MSH6 (SP93), PMS2 (A16-4), а также к BRAF V600E (VE1)¹.

Преаналитические требования. Ткань фиксируют в нейтральном забуференном формалине в течение 12–48 часов при комнатной температуре; объем фиксатора — 15–20 объемов ткани. Срезы толщиной 4 мкм наносятся на положительно заряженные предметные стекла. Следует использовать свежие срезы: антигенность снижается при длительном хранении¹.

Принцип интерпретации. Тест является качественным: пороговых значений для процента позитивных ядер не существует. Результат формируется путем сравнения интенсивности ядерного окрашивания опухолевых клеток с клетками внутреннего контроля (лимфоциты, фибробласты, эндотелиоциты, гладкомышечные клетки). В опухолях с сохранной системой репарацией (pMMR) ядерная экспрессия в опухолевых клетках всегда более выражена, чем в стромальных¹.

Паттерны dMMR. В рутинной практике встречается четыре паттерна истинного выпадения экспрессии:

• парная потеря MLH1/PMS2;
• парная потеря MSH2/MSH6;
• изолированная потеря PMS2;
• изолированная потеря MSH6.

Потеря оснований, не образующих функциональной пары, требуют молекулярно-генетической верификации^1,3.

Диагностические «ловушки»:

• Нарушения преаналитического этапа. При ненадлежащей фиксации сначала исчезает экспрессия в клетках стромы, а затем — в опухолевых. Снижение или отсутствие окрашивания одновременно в клетках внутреннего контроля и опухолевых клетках не должно интерпретироваться как dMMR¹.
• Гранулярный артефакт клона M1 (Roche). При применении антитела к MLH1 клона M1 с системой детекции OptiView возможно артефициальное точечное («гранулярное») ядерное окрашивание, которое не является подтвержденной экспрессией и расценивается как потеря. В рутинной практике изолированная потеря MLH1 в опухолевых клетках при сохранном внутреннем контроле нетипична: обычно инактивация MLH1 сопровождается вторичной потерей PMS2. Такой результат требует исключения артефакта и молекулярно-генетической верификации¹.
• Гетерогенное (субклональное) окрашивание. Внутриопухолевая гетерогенность с полной потерей экспрессии в одном субклоне при ее сохранении в другом расценивается как dMMR. Для таких образцов рекомендуется молекулярное исследование после макродиссекции¹.
• Изолированная потеря MSH6. Нарушение экспрессии может быть не связано с генетическим повреждением, а обусловлено нарушением регуляции гена MSH6 вследствие предоперационной химиотерапии¹.
• Ложноположительное окрашивание при миссенс-мутациях. Белки MMR, утратившие функцию вследствие миссенс-мутации, могут продолжать экспрессироваться, что ведет к ложно-pMMR результату при истинном dMMR. Этот феномен встречается примерно в 5% dMMR КРР⁶.
• Гетерогенный паттерн реакции на PMS2. Реакция с антителами к PMS2 любого производителя может быть неоднородной с очагами различной интенсивности. Это не следует расценивать как потерю экспрессии — необходимо сравнивать интенсивность ядер опухолевых клеток с ядрами клеток стромы¹.

В заключении ИГХ-исследования не должны указываться процентные значения ядерной реакции. Согласно руководству ВОЗ, термин «MSI» допустим в заключениях только при выполнении ДНК-анализа, а не ИГХ^1,5.

ПЦР с фрагментным анализом

Мультиплексная ПЦР с капиллярным электрофорезом считается «золотым стандартом» детекции MSI^1,3. С 1997 года применялась панель Bethesda (BAT25, BAT26 + 3 динуклеотидных маркера), требовавшая параллельного исследования нормальной ткани. С 2004 года внедрена усовершенствованная панель из 5 квазимономорфных мононуклеотидных маркеров (BAT25, BAT26, NR21, NR24, NR27), не требующая контроля, в большинстве случаев^1,3,6.

Область применения. Данная 5-маркерная панель оптимальна для КРР, рака желудка и тонкой кишки.

Требования к качеству материала. Содержание опухолевых клеток в парафиновом блоке (FFPE) — не менее 50%. При более низком содержании обязательна макро- или микродиссекция; при невозможности ее выполнения от молекулярно-генетического исследования следует отказаться. Присутствие сгустков крови ингибирует ПЦР^1,3.

Интерпретация. MSI характеризуется множественными пиками флуоресцентного сигнала (наличие аллельных вариантов); MSS — одним четким пиком. При нестабильности лишь 1–2 маркеров из 5 при исследовании опухолей ЖКТ необходимо дополнительно изучить нормальную ткань (лейкоциты крови) для исключения редких наследственных аллелей. При невозможности получения нормальной ткани применяют высокопроизводительное секвенирование (ВПС) или ИГХ^1,3.

Термин «MSI-L», описывающий нестабильность единственного маркера, является устаревшим: MSI-L биологически неотличим от MSS по мутационной нагрузке и числу нестабильных STR. Причиной артефактного дополнительного пика служат случайные мутационные события или присутствие редкого аллеля квазимономорфного маркера^3,5.

Высокопроизводительное секвенирование (ВПС, NGS)

ВПС позволяет одновременно оценивать молекулярные мишени для таргетной терапии и статус большого числа микросателлитных последовательностей^1,3. Ключевое преимущество — возможность дифференциальной оценки гистоспецифичных маркеров: изменения, приводящие к сдвигу рамки считывания, имеют определенную тканевую специфичность. Это существенно повышает точность предсказания ответа на иммунотерапию по сравнению со стандартной 5-маркерной панелью^1,3.

Классификационный порог для NGS-методов варьирует: для панельного и экзомного секвенирования традиционно применяется порог 20% нестабильных микросателлитов от числа валидных. Пограничные значения могут нуждаться в подтверждении оценкой мутационной нагрузки (TMB). При этом TMB и мутационные сигнатуры не должны использоваться как референсные методы при валидации MSI-анализа^1,6.

ВПС — дополнительный метод при расхождениях между ИГХ и ПЦР. В ряде случаев, особенно при нетипичной манифестации синдрома Линча, это единственный метод, которым можно определить, ответит ли опухоль на иммунотерапию¹.

Инактивация белков MMR при синдроме Линча сопровождается выраженной MSI только в опухолях с высоким индексом пролиферации. Опухоли с медленной пролиферацией могут демонстрировать dMMR в отсутствие выраженной MSI — с низкой мутационной нагрузкой и нечувствительностью к иммунотерапии^1,3.

Специфические нюансы и аналитические ограничения

Расхождения между ИГХ и молекулярными методами встречаются в клинической практике. ИГХ нечувствителен примерно в 5% dMMR КРР вследствие сохраненной экспрессии функционально нарушенных белков MMR при миссенс-мутациях⁶.

Опухоли с низкой пролиферативной активностью, в том числе часть новообразований, возникающих при синдроме Линча, могут демонстрировать dMMR с помощью метода ИГХ при отсутствии MSI методом ПЦР. Такие карциномы характеризуются низкой мутационной нагрузкой и отсутствием чувствительности к иммунотерапии, что имеет принципиальное клиническое значение для тактики лечения^1,3.

При синдроме CMMRD возможна изолированная потеря экспрессии одного белка MMR (MLH1, PMS2 или MSH6) во всех клетках тканевого образца — как в нормальных, так и в опухолевых. Это редкий, но важный диагностический паттерн, требующий исключения в соответствующих клинических ситуациях¹.

Источники

1. Цуканов А.С., Савелов Н.А., Завалишина Л.Э. и др. Методические рекомендации по тестированию микросателлитной нестабильности/дефицита белков системы MMR / А.С. Цуканов, Н.А. Савелов, Л.Э. Завалишина и др. — М.: ГБУЗ МКНЦ им. А.С. Логинова ДЗМ, 2025. — 47 с.
2. Цуканов А.С., Шелыгин Ю.А., Шубин В.П. Микросателлитная нестабильность при колоректальном раке: обзор литературы // Колопроктология. — 2017. — № 2 (60). — С. 100–104.
3. Демидова И.А., Филипенко М.Л., Цуканов А.С., Имянитов Е.Н. Микросателлитная нестабильность: нюансы лабораторной диагностики (позиция Межрегиональной организации молекулярных генетиков в онкологии и онкогематологии) // Вопросы онкологии. — 2023. — Т. 69, № 2. — С. 174–179. — DOI: 10.37469/0507-3758-2023-69-2-174-179.
4. Lemery S., Keegan P., Pazdur R. First FDA approval agnostic of cancer site — when a biomarker defines the indication // New England Journal of Medicine. — 2017. — Vol. 377, № 15. — P. 1409–1412. — DOI: 10.1056/NEJMp1709968.
5. Цуканов А.С., Демидова И.А., Цаур Г.А. и др. Диагностика синдрома Линча у онкологических пациентов: позиция Межрегиональной организации молекулярных генетиков в онкологии и онкогематологии // Вопросы онкологии. — 2023. — Т. 69, № 1. — С. 7–14. — DOI: 10.37469/0507-3758-2023-69-1-7-14.
6. Gallon R., McCormick L., Saetta A. et al. EMQN best practice guidelines for analysis and reporting of microsatellite instability in solid tumours // European Journal of Human Genetics. — 2026. — Vol. 34. — P. 134–146. — DOI: 10.1038/s41431-025-01913-x.
7. Янус Г.А., Иевлева А.Г., Мартыненко Д.Е. и др. Актуальные тенденции в поиске биомаркеров эффективности блокаторов контрольных точек иммунного ответа при колоректальном раке // Вопросы онкологии. — 2025. — Т. 71, № 2. — С. 297–305. — DOI: 10.37469/0507-3758-2025-71-2-OF-2207.